成都2023年6月28日 /美通社/ -- 成都康華生物制品股份有限公司（簡(jiǎn)稱：康華生物）全資子公司康華動(dòng)保（成都）生物科技有限公司（簡(jiǎn)稱:康華動(dòng)保）和杭州佑本動(dòng)物疫苗有限公司（簡(jiǎn)稱:杭州佑本）技術(shù)合作，共同打造了一款用于預(yù)防寵物狂犬病的產(chǎn)品 -- 希利斯。

狂犬病是一種致死性傳染病，所有溫血?jiǎng)游锇ㄈ祟惥筛腥荆腥竞蟮慕Y(jié)局為100%死亡。狂犬病的足跡遍布全球150多個(gè)國家和地區(qū)，據(jù)WHO數(shù)據(jù)顯示，狂犬病每年可造成全球6萬左右人類死亡，對(duì)人類及動(dòng)物生命、社會(huì)資源及國家公共衛(wèi)生體系構(gòu)成嚴(yán)重威脅^[1、2]。

狂犬病的最早文字記載見于公元前23世紀(jì)的埃什努納（現(xiàn)伊拉克）法典，該法典規(guī)定了主人看管不當(dāng)致使犬傷致死所應(yīng)承擔(dān)的責(zé)任。中國早在2500多年前就有狂犬病犬的存在，我國關(guān)于狂犬病的記載最早見于《左傳》“（魯）襄公十七年十一月甲午國人逐瘈狗。”其中的“瘈”即瘋之意^[5]。

在人類對(duì)狂犬病認(rèn)識(shí)的過程中，最具有里程碑意義的工作當(dāng)屬19世紀(jì)80年代法國科學(xué)家路易斯·巴斯德等人的重大發(fā)現(xiàn)。巴斯德發(fā)現(xiàn)了腦組織（和脊髓）是患者體內(nèi)病毒所在位置，并證明將病毒注射至腦內(nèi)后，可以致使感染動(dòng)物的麻痹和死亡，并認(rèn)識(shí)到連續(xù)腦內(nèi)接種可用于病毒傳代。同時(shí)，巴斯德及其同事，通過在犬腦硬膜下接種和在家兔腦內(nèi)連續(xù)傳代的方法，使街毒變成了固定毒。1885年，巴斯德等人利用固定毒，成功制備了疫苗，從此開啟了狂犬病預(yù)防的新時(shí)代 ^[5、6] 現(xiàn)今成熟應(yīng)用于狂犬病預(yù)防的狂犬病疫苗毒株P(guān)M株、PV株，均源自于巴斯德株。

狂犬病疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，主要有轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、細(xì)胞工廠培養(yǎng)和生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)等。傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)工藝如轉(zhuǎn)瓶、細(xì)胞工廠等，存在細(xì)胞培養(yǎng)過程中外源蛋白污染及產(chǎn)品批次內(nèi)與批次間不穩(wěn)定等因素，目前，利用生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)來生產(chǎn)狂犬病疫苗已成為最普遍的技術(shù)，較傳統(tǒng)的狂犬病疫苗生產(chǎn)工藝有很大的提升，有效保證了產(chǎn)品批次的穩(wěn)定性，其中利用生物反應(yīng)器進(jìn)行全懸浮細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)制備抗原液，更是目前生產(chǎn)寵物狂犬病滅活疫苗最先進(jìn)的工藝^[3、7-8]。

另外，傳統(tǒng)的狂犬病疫苗生產(chǎn)工藝（轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、細(xì)胞工廠等），在產(chǎn)能及異源蛋白去除方面參差不齊。且我國用于動(dòng)物的狂犬病疫苗研究及推廣技術(shù)，明顯落后于人用狂犬病疫苗，在動(dòng)物免疫上存在很多不規(guī)范問題^[9-10]。現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，也在不斷推動(dòng)獸醫(yī)生物制品制造工藝的新突破，漸漸地，人們也從重點(diǎn)關(guān)注疫苗的免疫效力轉(zhuǎn)移到了對(duì)不良反應(yīng)的關(guān)注，在這一過程中，“純化”工藝在現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)中具有極致的魅力^[11]。分離純化工程技術(shù)，也成為了決定獸用物制品純度、效力、質(zhì)量安全水平的關(guān)鍵因素^[12]。

2014年，成都康華生物制品股份有限公司（以下簡(jiǎn)稱：康華生物）生產(chǎn)的“凍干人用狂犬病疫苗(人二倍體細(xì)胞)”，商品名:HDCV上市，標(biāo)志著中國狂犬病疫苗迎來了“人源”時(shí)代。康華生物HDCV產(chǎn)品安全性好，適合全人群，且免疫持久性長達(dá)10年^[4]。

希利斯是康華生物全資子公司康華動(dòng)保（成都）生物科技有限公司（以下簡(jiǎn)稱：康華動(dòng)保）和杭州佑本動(dòng)物疫苗有限公司共同技術(shù)合作的一款用于預(yù)防寵物狂犬病的產(chǎn)品，創(chuàng)新引用人狂犬病滅活疫苗生產(chǎn)技術(shù)-層析純化，有效去除大分子物質(zhì)，以及過濾難以去除的蛋白成分和小分子物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)病毒蛋白高度純化，是市面上首個(gè)采用層析純化技術(shù)的寵物精制狂犬病疫苗。

那么，疫苗具備什么樣的特點(diǎn)才能被判定為精制苗，要從以下指標(biāo)來看：（1）抗原含量（2）穩(wěn)定性（3）純度（4）臨床副反應(yīng)（5）免疫效果。

以下為希利斯的相關(guān)數(shù)據(jù)。

一、抗原含量

根據(jù)《獸用生物制品生產(chǎn)與檢驗(yàn)報(bào)告》^[13]數(shù)據(jù)顯示，隨機(jī)抽取的4個(gè)連續(xù)批次希利斯產(chǎn)品成品效力均在6 IU/dose以上（平均值為6.975 IU），遠(yuǎn)高于WHO規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（大于等于1IU），見表1。

二、穩(wěn)定

希利斯采用全懸浮技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)（圖1），為數(shù)字化可控系統(tǒng)，全程精準(zhǔn)監(jiān)控、調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)、病毒繁殖過程中的各項(xiàng)工藝參數(shù)，合理選擇細(xì)胞接毒時(shí)機(jī)，完美控制病毒培養(yǎng)狀態(tài)，這是單位體積培養(yǎng)液中抗原含量高、產(chǎn)品批次內(nèi)/間差異小的決定性因素，進(jìn)而有效的保證了產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控。

另希利斯的保存期研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)疫苗在37攝氏度存放15、30天，2-8攝氏度保存3、6、9、12、18、24、27個(gè)月，其外觀性狀、無菌、安全、效力、異常毒性和內(nèi)毒素等各項(xiàng)檢驗(yàn)都符合《犬狂犬病滅活疫苗（PV/BHK-21株）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求，證明疫苗可在37攝氏度保存30天，在 2-8攝氏度保存27個(gè)月，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可靠^[14]。

三、純度

由于采用了生物反應(yīng)器全懸浮大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，單位體積培養(yǎng)液中的抗原含量是常規(guī)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、細(xì)胞工廠培養(yǎng)、微載體懸浮培養(yǎng)方式制備的抗原含量5~10倍，高濃度的抗原是保證后期進(jìn)行純化的基礎(chǔ)。選取疫苗生產(chǎn)過程中病毒滅活后的濃縮樣本及層析純化樣本進(jìn)行電鏡觀察，檢測(cè)病毒粒子的濃縮與純化效果。電鏡觀察顯示，濃縮樣本病毒粒子相對(duì)較多，聚集成堆，見圖2-A。再經(jīng)層析純化后疫苗中的病毒粒子進(jìn)一步富集，純度較高，見圖2-B。

為了解濃縮和層析純化后樣本中狂犬病病毒蛋白純度，對(duì)濃縮樣本及層析樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，見圖2-C。泳道1-3分別為希利斯20220201批， 6倍稀釋的濃縮樣本、 1#層析樣本、 2#層析樣本。結(jié)果可見清晰的與理論上狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白份分子量大小符合的條帶（G蛋白，約67kDa；N蛋白，約55kDa；M1蛋白，約38kDa；M2蛋白，約26kDa；），經(jīng)過純化后的樣本，與狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白分子質(zhì)量大小不符的條帶幾乎不可見；可見，疫苗中雜蛋白去除率高達(dá)99.9%。電鏡和電泳結(jié)果充分地證明了希利斯產(chǎn)品中病毒抗原粒子完整，并且抗原液得到了良好的濃縮和純化，這是疫苗有效性和安全性的有力保證。

注：A. 濃縮樣本電鏡觀察結(jié)果（×20K）；B.層析純化樣本電鏡觀察結(jié)果（×70K）；C.濃縮及層析樣本SDS-PAGE電泳圖

四、臨床副反應(yīng)

《犬狂犬病滅活疫苗（PV-BHK-21株）安全性研究報(bào)告》^[15]數(shù)據(jù)顯示，通過用3批實(shí)驗(yàn)室制備的希利斯進(jìn)行的各項(xiàng)安全性試驗(yàn)，試驗(yàn)內(nèi)容包括：對(duì)最小使用日齡（3月齡）比格犬，一次單劑量接種的安全性試驗(yàn)、單劑量重復(fù)接種試驗(yàn)、一次超劑量接種試驗(yàn)、對(duì)妊娠犬的安全性和生產(chǎn)性能影響試驗(yàn)以及對(duì)不同品種犬（如京巴犬、沙皮犬等）的安全性試驗(yàn)，結(jié)果表明，所有試驗(yàn)動(dòng)物未出現(xiàn)明顯的局部和全身的反應(yīng)，對(duì)妊娠犬安全且其生產(chǎn)性能不受影響，接種疫苗的豚鼠和小鼠未出現(xiàn)異常。

2022年5月22日康華動(dòng)保啟動(dòng)的《希利斯臨床數(shù)據(jù)研究試驗(yàn)》數(shù)據(jù)顯示^[16], 對(duì)200多只試驗(yàn)所涉及的犬只品種（比格犬、泰迪、約克夏、法斗、吉娃娃、柯基、西高地、貴賓、中華田園犬、冠毛犬）進(jìn)行疫苗免疫后臨床不良反應(yīng)觀察，希利斯針對(duì)試驗(yàn)犬免疫，試驗(yàn)犬均無不良反應(yīng)發(fā)生。

六、免疫效果

根據(jù)《希利斯臨床數(shù)據(jù)研究試驗(yàn)》數(shù)據(jù)^[16],試驗(yàn)犬所設(shè)計(jì)品種及其幼齡犬、老齡犬均能產(chǎn)生有效的狂犬病病毒中和抗體，免疫成功率為100%，結(jié)合《希利斯臨床數(shù)據(jù)研究試驗(yàn)》及《狂犬病滅活疫苗（PV/BHK-21株）免疫產(chǎn)生期和免疫持續(xù)期的研究報(bào)告》^[17]數(shù)據(jù)顯示，試驗(yàn)犬在免疫后7天以后均能測(cè)到保護(hù)性抗體，抗體水平在21天左右到達(dá)高峰，之后逐漸下降，至12個(gè)月時(shí)，抗體水平仍遠(yuǎn)大于最低保護(hù)量0.5 IU，在1.0 IU以上，見圖3-A、3-B。以上研發(fā)及臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，希利斯能誘導(dǎo)犬產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，免疫效果持久。

注：A.《狂犬病滅活疫苗(PV/BHK-21株)免疫產(chǎn)生期和免疫持續(xù)期的研究報(bào)告》；B.《希利斯臨床數(shù)據(jù)研究試驗(yàn)》

綜上所述，經(jīng)過鏈接人用狂犬病滅活疫苗生產(chǎn)-層析純化技術(shù)的希利斯，高效、安全、穩(wěn)定、臨床副反應(yīng)低，免疫效果持久，這是更高標(biāo)準(zhǔn)的寵物疫苗。希利斯，開啟寵物精制苗時(shí)代。